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１ 目的
| 本実験は，ＤＮＡの抽出過程のしくみについて可視的に解説し，界面活性剤や変性剤の働きやエタノール沈殿といったDNA抽出過程のポイントの意味について理解することを目的とする。 |
２ ＤＮＡの抽出（核酸の抽出）方法
| ◎ | ＤＮＡの抽出法 | |||||
| 口腔粘膜の細胞を綿棒等を使って取る。 | しぼり出すように，懸濁液を作成する。 | |||||
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| 次に，タンパク質を除去するためにタンパク質を分解する酵素を加え，あるいは，尿素やクロロホルムでタンパク質を変性させる。こうしてタンパク質を除去した後，遠心すると三層に分離する。一番上の層にＤＮＡが溶けているので，その層だけを別のチューブに移し変え，ＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡはアルコールに溶けないのでエタノールなどで沈殿させることができる。水に溶けたＤＮＡを100％エタノールに移す。 |
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| 遠心分離し沈殿物を塩類溶液に溶かし，更にエタノール沈殿を繰り返し精製する。沈殿物を乾燥させ，ＴＥ（バッファー）を加えれば抽出は完了である。 | ||
| → ＤＮＡの抽出と精製方法の詳細（こちら） | ||
| → ＤＮＡの精製と純度の測定（こちら） |
３ ＰＣＲ反応
| このＴＥ（バッファー）に溶かしたＤＮＡがＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡとなる。 |
４ 電気泳動
| (1) | 電気泳動のしくみ | |
| ＰＣＲ産物（ＤＮＡ）は，ＤＮＡの構成単位となるヌクレオチドがリン酸を含み，全体に均等にマイナスの電荷を帯びている。電圧をかけた電解質の水溶液中で，ＤＮＡは陽極に引かれて移動する。ＤＮＡは網目状の分子構造を持つアガロースゲルの中では，その分子量（長さ）に応じて移動速度が異なり，この違いを用いて分離，検出する。 |
| (2) | 電気泳動装置 | |
| アガロースゲルをセットし，ＴＡＥ（バッファー）を満たし，ＤＮＡをウェル（穴）に注入し，50Ｖまたは100Ｖの電圧をかける。ＤＮＡの移動速度は，ＤＮＡの分子量（長さ）の他に，温度，アガロースゲルの質や濃度，バッファーの種類や濃度によっても異なる。 |
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| (3) | ＤＮＡのアプライ | ||
| ア | ゲルの作成 | ||
| イ | ローディングバッファーとＰＣＲ産物（ＤＮＡ）の混合 | ||
| ＤＮＡを電気泳動する際には，あらかじめＤＮＡをローディングバッファーと混合する。これによりＤＮＡは，泳動バッファー中に拡散することなく，アプライすることが可能となる。ローディングバッファーには，ＤＮＡを注入しやすくするために，ＤＮＡにとろみをつけるためのグリコーゲンや，キシレンシアノール（XC：黄色）やブロモフェノルブルー（BPB：青）の色素が含まれている。さらに色素は，透明なＤＮＡの移動度を推定するための目印になる。 | |||
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| ウ | ＤＮＡの染色剤のEt-Br（エチジウム・ブロマイド）が，ＴＡＥとゲル版に溶かしてある。ゆっくりとEt-BrがＤＮＡに結合する。EtーBrと結合したＤＮＡは紫外線を当てると蛍光を発し，検出することができる。 |
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| (4) | 電気泳動 |
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５ いろいろなＤＮＡ分析
| ◎ | ヒトのALDH２の検出 | |||||||||||||||||||||||||||
マーカー A A' B B' マーカー |
Ａ，Ｂの２名についてALHDH２遺伝子と，ALDH２変異型について，もっているかいないかを調べた。
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| ◎ | メダカのミトコンドリア多型の検出 | |||
A B C D E マーカー |
Ａ〜Ｅは，１個体のヒレから取った組織のミトコンドリアのＤＮＡをＰＣＲで増幅し，５種類の制限酵素で切断したものである。 ＰＣＲプライマーによって増幅する部分の両端20塩基ずつの40塩基のチェックができる。 ５種の制限酵素（各々約６塩基認識）によってＰＣＲ産物の内部の塩基配列の違い（ＤＮＡ多型）のチェックができる。 日本中のメダカの分析結果と照らし合わせて，どこのメダカが同じタイプかを推定することができる。 |
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| ◎ | タンポポの葉緑体DNAの分析 | |||
マーカー  |
日本に生育するタンポポには，在来種のニホンタンポポと，その他に帰化種のセイヨウタンポポやアカミタンポポが混在している。その中で在来種と帰化種の雑種化が起こっていることが知られている。植物細胞には，核やミトコンドリア内の他，葉緑体にもＤＮＡが含まれている。葉緑体ＤＮＡは卵細胞を経て母親から子供に伝わる。 左の写真では，上のバンドが在来種のもので，下のバンドが帰化種のものである。 ２番の個体は，ニホンタンポポであるが，核は，帰化タンポポのもののみを示した。帰化タンポポの花粉の核が，ニホンタンポポの卵細胞内で発生し，ニホンタンポポの核を排除した例（雄核単為生殖）と考えられている。 核がセイヨウタンポポとニホンタンポポの雑種でも，細胞質が在来種だったり帰化種だったりするものがある。 |
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| ◎ | ヒトのミトコンドリア多型の分析 | |||
ﾏｰｶｰ A A’ B B’ C C’ D D’ E E’ F F ’  |
Ａ〜Ｆの６名のヒトミトコンドリアＤＮＡのある領域を，２種類の制限酵素で切断したものである。何通りかの制限酵素で切断することで，縄文人に多いタイプか，弥生人に多いタイプかなど，ヒトの起源に関する情報が得られ，世界中の化石や現代人のデータと，自分のＤＮＡを比較することができる。 | |||
６ プライバシーポリシー
| このようなＤＮＡ分析においては，個人情報の取扱いに十分配慮すべきである。先ずは，実験テーマの選び方が問題となる。ガンや糖尿病，肥満に対するリスクなどの遺伝子判定は行うべきではない。また，ＡＢＯ式血液型や耳垢の湿性，乾性など，差別とは縁遠く思えるテーマでも，社会的背景が変わることでどのように判断が変わるかは分からない。 遺伝的多型といって，遺伝子を用いていろいろなタイプにヒトを分けることができるが，一般的に遺伝子頻度の低いものは遺伝病と言われることが多く，差別の対象となり易いので扱うべきではない。血液型では差別されることはまず無いと考えられるが，鎌形赤血球症や血友病では，差別が無いとは言い切れない。また，まだまだ差別があると言われる色覚のタイプも遺伝的多型である。従って，特にヒトの遺伝子を用いる場合，差別の芽がどこに潜んでいるかは分からないので，個々の生徒にまで目の行き届いた十分な配慮が必要である。 ことさら未成年の高校生のＤＮＡを用いる場合は，個人情報の取り扱いに十分留意し，実験目的や実験で分かることについて，十分な説明を行う必要がある。また，保護者に対しても校長名で説明文を出すなどして，理解を求めるべきである。同意書（承諾書）(doui_syo.doc)（クリックした後，任意の場所にファイルを保存してください）を取って，承諾の意思の確認を残しておくべきである。 ＤＮＡ分析においては，抽出したＤＮＡは，ゲノムＤＮＡといわれ，その生物の遺伝子をすべて含んでいる。ＰＣＲで増幅するのは特定部位のみではあるが，抽出したＤＮＡは，全ての遺伝子を含んでいる上に，長期保存にも耐えることができる特性をもっている。従って，教育現場では，実験が終わった時点で抽出したＤＮＡを速やかに廃棄することが重要である。 |
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